当你换过序列、调过条件、对过对照，敲低效率依然不理想时，不必在 siRNA 这一条路上死磕。本篇给出 3 条成熟的替代路径，并在文末附上一张覆盖全系列的排查速查表，方便你对号入座。
先想清楚：多少效率才算"够用"
干扰效率的高低因不同的细胞类型和不同基因而异，并不存在一个放之四海而皆准的及格线。判断标准是能否稳定重现你关注的表型，而不是数字好不好看。
路径一：换序列，或把多条 siRNA 混合使用
在多次改进实验条件和更换干扰序列后仍然达不到理想干扰效率时，可以考虑：
· 直接使用可引起表型变化的序列进行实验——能出表型的序列就是可用的序列；
· 将多条 siRNA 混合转染（pool），在总浓度不变的前提下提高对靶基因的敲低效果，同时摊薄单条序列的脱靶风险；
路径二：换递送方式
很多"效率低"其实不是序列的问题，而是递送的问题。
· 难转染细胞（干细胞、悬浮细胞、原代细胞等）：可采用电转，或改用病毒递送 shRNA；
· 核内定位的 lncRNA：lncRNA 的转录发生在细胞核内，最终有的分布于细胞质，有的分布于细胞核，也有的在核质中均有分布。对于胞质分布的 lncRNA，采用 siRNA 等常规干扰手段即可实现敲低；而对于核内表达的 lncRNA，由于 siRNA、shRNA 主要在细胞质中发挥作用，大部分核内 lncRNA 依然难以被敲低。这种情况下可使用反义寡核苷酸（ASO）来敲低核内分布的 lncRNA，或直接采用 CRISPR 技术在基因组上敲除该 lncRNA。
▎ 关于核内 lncRNA 的现实预期
虽然文献中存在 shRNA 成功干扰核内 lncRNA 的案例，但从机制上讲，RNAi 机器的核心组件主要富集在胞质，核内靶点本身就处于劣势。如果你的靶点是核内 lncRNA，建议一开始就评估 ASO 或 CRISPR 方案，避免在 siRNA 上反复试错。
路径三：直接敲除——从基因组水平实现功能缺失
如果实验目标是彻底的功能缺失、需要长期稳定的表型，或者靶点本身不适合 RNAi，可以采用 CRISPR/Cas9 技术直接敲除基因，从基因组水平实现靶基因功能缺失的目的。相比 RNAi 的"敲低"，敲除带来的是不可逆、不依赖持续转染的效果。
三条路径怎么选
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场景 |
推荐路径 |
说明 |
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常规贴壁细胞，siRNA 效率 60%~80% |
换序列 / 多条 siRNA 混合 |
成本最低，优先尝试 |
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干细胞、悬浮细胞、原代细胞等难转染体系 |
电转 / 病毒递送 shRNA |
先解决递送，再谈效率 |
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核内定位的 lncRNA |
ASO 敲低 / CRISPR 基因组敲除 |
RNAi 机制上不占优势，不宜反复试错 |
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需要长期、稳定、彻底的功能缺失 |
CRISPR/Cas9 基因敲除 |
从基因组水平实现不可逆敲除 |
全系列排查速查表
下表汇总了本系列 4 篇文章覆盖的全部问题，可按现象快速检索。
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现象 |
关键原因 |
优先处理方向 |
出处 |
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配制复合物加血清后效率低 |
血清蛋白干扰复合物形成并带来毒性 |
混合体系无血清无抗生素，培养基可含血清 |
01 |
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转染后细胞状态差 |
试剂毒性 / 细胞代数密度 / 靶基因参与应激 |
优化试剂用量与时间、换低毒试剂、调检测时间 |
01 |
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想加倍 siRNA 浓度 |
高浓度增加脱靶与毒性 |
先换序列，再在 10~150 nM 内梯度优化 |
01 |
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qPCR 无显著变化 |
操作/时间/细胞/序列四要素 |
24~48 h 检测、查转染效率、换序列、-20℃ 保存 |
02 |
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mRNA 降但蛋白不降 |
检测过早 / 翻译调控维持平衡 |
延后蛋白收样；必要时更换细胞 |
02 |
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目的基因反而上调 |
转染刺激 / 检测误差 |
优化转染条件、提升 RNA 质量与引物、设对照 |
02 |
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干扰后 miRNA 不降 |
inhibitor、sponge 只结合不降解 |
改测下游靶基因、荧光素酶报告基因或表型 |
02 |
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阴性对照也有敲低 |
试剂非特异作用 / NC 序列脱靶 |
设 mock 组区分来源；优化条件或更换 NC |
03 |
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不同基因 NC 结果相差大 |
脱靶、试剂浓度、引物特异性、细胞反应差异 |
同批次同细胞设各自 NC，统一操作 |
03 |
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同 siRNA 不同细胞效果不同 |
细胞信号通路、表达水平、生理特性差异 |
在目的细胞中重新验证，选取高效序列 |
03 |
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干扰效率不高仍需推进 |
效率因细胞与基因而异 |
用可出表型的序列、多条混合、换递送或 CRISPR 敲除 |
04 |